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点击cishu:250 发bu时jian:2020-05-27

(一)准备和安装过滤器 

清洗好过滤器,干zao,放ru一张孔径0.22μm的微孔滤膜,用bu包装好,15磅20 minjin行高压灭jun处理。 在超净台内打开过滤器架好,胶管一端接ru滤泵再charu待除jun的液体中,出kou端胶管深ru到已消毒好的ping子中。用泵过滤,过滤后yaojian查滤膜是否完好无损。 

(二)合成培养基的配制

1、根据细胞目lu中的说明,按下表xuan择合适品牌及货号的培养基干粉,用适量超纯水充分溶jie。

2、 按yao求添加碳酸qing钠、谷氨酸钠、HEPES等,充分搅拌使zhi溶jie。

3、 diao pH至7.2左觵aoⅫ/p>

4、 加水至zui终体积。

5、 在超净台中对溶液jin行滤过除jun,分装ru250 mL或500 mL玻璃ping中,用翻帽塞塞紧pingkou。

6、 pingkou封好,4℃bing箱贮存。 

(san)小牛血清的处理 

市场上出售的小牛血清一般zuo了灭jun处理,但在使觤en盎褂uo热灭活处理,即通过加热的fang法po坏补体(近来也有观点renwei热灭活处理是不必yao的)。tai牛血清不必灭活。

1、 jiang血清加热至56℃并bao持30 min,qijianyao不时轻轻晃动,使受热均匀,fangzhi沉dianxi出。

2、 处理后的血清贮存于4℃。

3、 小牛血清在使觤en癹in行筛xuan以掌握血清的zhi量。

(四)生长培养基的配制 

除无血清培养zhi外,各种合成培养基在使觤en靶杓觬u一定量的小牛血清或tai牛血清和抗jun素。 

培养基分装成小ping(100~200 mL)襶uan闶褂茫比魀ingkou。 

按如下比例配制: 基本培养基占80%~90%,小牛血清或tai牛血清占10%~20%。 按1%体积分shu加ru双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度穤hi饂ei100 U/mL和100 μ/mL,。 

wu)冻存细胞的复苏 

应遵shou慢冻快融的yuan则。先jiang水浴锅diao至37-37。5度,取出冻存的细胞迅速放ru后jiang细胞面浸至水面以下不断yao动至融化。 

在无jun台内jiang完quan培养基加ru50ml的小培养ping内,yue5ml左右,萮uan笥梦辥un吸管从冻存管内取出细胞,置培养并内轻轻yao晃,使细胞均匀后置培养箱内培养。

(liu)传代、tie壁细胞:

对于tie壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的yue干净yue好,以免中和后加ru的消化液,使强度jianruo(或PBS洗1-3ci)。50ml培养ping加ru消化液yue1-3ml,按此比例jin行消化,(根据经验),晃动使消化液pu均匀置37度培养箱yue2-5分钟,jing蟣u赴鹲hou缩变圆或少shu脱落后,轻轻振动ping底使细胞quanbu脱落,加ru2-3ml完quan培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成dan个悬浮,萮uan蠓种胵i它无jun培养ping内,加ru完quan培养基后继续培养或实验。 

悬浮细胞:

一般传代可zhi接jiang细胞yuan液分置qi它培养ping内,加ru完quan培养基继续培养,如yao高浓度可先离心1000rpm,5min后加ru完quan培养基,轻轻吹匀后,分置qi它培养ping内加ru完quan培养基继续培养。

(七)冻存 

jiangtie壁细胞消化后离心shouji,悬浮细胞zhi接离心shouji,以完quan培养基或tai牛血清zhong悬细胞至终浓度yue106/ml。加ru10%的DMSO。以每管1~2ml分装至冻存管中。用绝热cai料包裹置-70摄shi度bing箱冷冻。ci日bao存到液氮中。 

(ba)注意shi项
玻璃吸管和玻璃培养ping的消毒:
1)高压蒸汽灭jun15分钟以上;
2)干烤消毒140度2小时以上; 无jun工作台先清洗后用75%jiu精擦拭干净,紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上; 培养基(pH7.2)和血清配制好后yaozuo无jun试验:jiang血清按10%加ru培养基内,用无jun的玻璃离心管或玻璃ping取完quan培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,肉yan见无浑浊或沉dian等异物。分装后置4度bao存; 消化液(pH7.8)或qi它加ru液,应用高压蒸汽灭jun或一ci性无jun滤器过滤除jun,分装成支置-20度bao存; 培养箱应先觤en逅逑春笥?5%jiu精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上,如有高温灭jun的应按程xu来jun)。至少每yue一ci。 

jinru操作时应注意先清洗双shou及shou腕,萮uan笥?5%jiu精擦拭,操作时注意无jun台内空jian层ci。shou及物品不yao在暴露的pingkou上fang来wang,如guoshu量较多,培养ping应放在与jiu精deng平行地fang便于操作,ping与pingzhijian应相ge一定的距离,开ping(盖)时应先用75%jiu精反复擦拭或用dengshao,打开后应用deng先shaokou,萮uan髎hao盖。用完后同样操作。整个操作过程尽量在无jun台kao里面一点。 

 
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